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高分子材料工程---温度敏感型胶原蛋白肽

来源: 长沙中视澜庭教育咨询有限公司  日期:2018-01-13 16:02:01  点击:123 
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摘要
胶原蛋白是人体中含量最丰富的蛋白质之一,具有良好的生物相容性,其中动物提取胶原蛋白已被广泛应用于食品、化妆品和临床医学等领域。将胶原蛋白多肽进行改性,实现其对温度的响应性不仅可以为多肽二级结构的研究设计提供新思路,还可以为新型功能化胶原蛋白材料的应用和设计提供理论基础。课题组前期合成制备了基于烷氧醚树枝化基元的树枝化聚合物和树枝状大分子,具有优良的温度敏感性。因此本文设想在羟脯氨酸4位羟基处引入树枝化烷氧醚侧基,赋予聚胶原蛋白肽以温度敏感性。本文最终通过大单体路线成功制备了末端为乙氧基的一代烷氧醚树枝化聚胶原蛋白肽,并尝试制备相应的二代聚多肽。
关键词:温度敏感性  胶原蛋白肽 烷氧醚 树枝化
第一章  绪论
引言
    一般来说智能聚合物是指一类所在外部的环境发生微小变动时如pH值,离子浓度,温度,机械力,光,电、声场、磁等,其物理性能和/或化学结构会发生可逆或者是不可逆的变化。当受外部刺激之后,智能聚合物材料的变化可能是溶解度、自组装方式或者是链构象的转变。在科技高度发达的今天,生活方式的多样化促使人们对材料提出了更高的要求,材料的开发也逐步进入智能材料设计这一崭新的发展阶段。 智能聚合物材料则是一种能够判断并适当处理且本身可执行并能感知外部刺激的新型功能材料。智能材料具有七大功能:自诊断能力、反馈功能、信息识别与积累功能、响应功能、传感功能、自修复能力和自适应能力,是现代高科技新材料快速发展的重要方向之一,并将在未来支持和推到高新技术的发展。
 
1.1智能多肽聚合物的概述
  1.1.1 智能多肽聚合物概述和发展
    多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质, 是介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物, 由多种氨基酸按照一定的排列顺序并且通过肽键的结合而成。由于多肽链段上氨基酸残基具有不同的化学结构, 多肽可以利用其肽键间氢键作用以及氨基酸残基之间的氢键作用、静电作用、疏水性作用以及π-π堆积作用等有效实现分子自组装. 自然界常见的氨基酸有20 种, 通过分子设计和多肽合成等手段可以得到成千上万种结构特异、具有不同功能的多肽, 有利于多肽自组装的基元选择和自组装条件的优化。 在此之外,因为多肽是涉及生物体内各种细胞功能,并且具有良好的生物相容性、可控的降解性和生物活性物质,相对于其他类型的自组装体系,多肽自组装则有着更为广阔的发展前途,尤其是在基因治疗、组织工程、生物传感器等生物医学领域。
过去十年间,基于多肽和聚多肽类生物纳米材料迅速发展,使能源、纳米技术和生物医药等领域进入了崭新的发展阶段,为新型材料开发开辟了一个方向。进而多肽的自组装引起国内外研究人员越来越大的研究兴趣. 1993 年, Ghadiri 等设计并合成了含有8 个氨基酸残基的环肽(cyclo-[(L-Gln-DAla-L-Glu-D-Ala)2-]), 通过交替改变分子结构中氨基酸残基的空间构象(L 型和D 型), 该环肽可以在水溶液中自组装形成纳米管状结构[5]. 同年, Zhang 等报道了一种可以自组装形成水凝胶膜的离子互补型十六肽。随后, 一系列具有自组装行为的多肽相继被报道。
在科技高度发展的今天,生活方式的多样化促使人们对材料提出了更高的要求,材料的开发业主不进入智能材料设计这一新的发展阶段,自然界含着各种各样的智能材料设计灵感的源泉。就多肽而言,除了具有特定的氨基酸序列(称为一级结构)外,还通过多肽分子内氢键、静电作用、疏水作用、二硫键等弱相互作用形成局部区域内的有序排列,使肽链产生特定的二级结构。外部环境变化会影响其结构和性质发生相应改变,而这些变化通常伴随着多肽亲疏水基团空间上的重新排列。科学家们希望通过改变外部条件诱导多肽二次有序构象变化从而实现对多肽自组装的控制。同时,多肽通常还具有很好的生物可降解性和生物相容性,在组织工程、生物传感器、智能生物材料以及药物释放领域也有潜在的应用价值。因此,具有刺激-响应行为的智能多肽聚合物已经成为国内外高分子科研工作者关注的热门研究方向。诱导智能多肽聚合物改变的外部因素是多方面的,其影响条件包括温度,光照,辐射,金属离子或者PH,离子浓度等。其中,在这几种中温度控制是最重要的手段之一,因其操控十分方便,并且无污染以及应用领域广泛而得到人们的关注。
1.1.2基于二次结构形成的多肽自组装
    多肽的一级结构也即为其化学结构,把多肽溶解于水中观察发现,多肽分子能够自发性或者触发地向二级结构转变过去。而这种空间构象的转变往往即会导致多肽自组装这种行为的发生。多肽自组装过程中常见的二级结构主要包括α-螺旋(α-helix)、β-折叠(β-sheet)、β-发夹(β-hairpin)等。
α-螺旋是多肽类分子主要的二级结构, 空间上表现为多肽链段上肽键通过氢键作用形成的单一的螺旋结构(图1(a))。在构建α-螺旋结构时, 由于每一个螺旋状的旋转需要大约3.6个氨基酸残基,因此多肽链段上3到4个氨基酸残基组成的多肽片段需要具有类似的化学性质,如亲疏水性等。由于α-螺旋的热动力学不稳定性, 在溶液中往往难以稳定的螺旋形式存在。因此, 稳定α-螺旋构象对于此类多肽的自组装研究具有极其重要的意义。常用的方法有化学交联在α-螺旋结构中同一侧面的氨基酸残基、氢键配对、金属配位以及盐桥作用等。例如, Kumita 等[2]利用多肽固相合成技术得到了含有两个半胱氨酸(C)残基的十六肽(acetyl-EACARVAibAACEAAARQNH2,两个半胱氨酸残基分别位于i 和i+7 位)。如图1(b)所示, 用含有偶氮苯基团的交联剂对两个半胱氨酸残基进行交联后, 由于在光照的条件下偶氮苯基团可以实现反式到顺式的转变, 导致该肽在水溶液中的α-螺旋结构大大增加并趋于稳定, 这样也使得其自组装行为具有光敏感特性。同时,他们还进一步研究了两个半胱氨酸残基分别位于i 和i+4 位(acetyl-EAAAREACARECEAARQ-NH2, FK-4-X)以及i 和i+11 位(acetyl-EACAREAAAREAACRQ-NH2, FK-11-X)的两种肽的自组装行为[3]. 通过含有偶氮苯基团的交联剂对两个半胱氨酸残基进行交联, 顺式的偶氮苯基团有利于FK-4-X 肽在水溶液中形成稳定的α-螺旋结构, 而反式的偶氮苯基团则有利于FK-11-X肽在水溶液中形成稳定的α- 螺旋结构( 图1(c)。Mihara[5] 等设计合成了Ac-AAEALLKAHAELLAKAAGGGC-NH2 二十一肽。在水溶液中, 多肽链段上谷氨酸(E)残基和赖氨酸(K)残基间的盐桥作用在一定程度上能够稳定α-螺旋结构。同时该种多肽结构上半胱氨酸残基可以通过二硫键交联形成二聚的H2α-17 肽。这种新形成的H2α-17 肽结构中的两个组氨酸(H)残基通过与血红素识别形成金属配位桥联的平行α-螺旋链, 导致α-螺旋的稳定性显著增强, 能够自组装形成稳定的纳米聚集体。另外Lee 等[6]巧妙地利用多肽分子的β-折叠(β-sheet)结构来增强和稳定α-螺旋构像。研究发现, 孤立的AAAAKAAAAK 多肽片段在水溶液中只有部分形成α-螺旋结构,而将AAAAKAAAAK 多肽片段与WKWEWKWEW 多肽片段相连形成环状多肽后,WKWEWKWEW 多肽片段形成的β-折叠有序排列能够有效地诱导AAAAKAAAAK多肽片段形成稳定的α-螺旋结构,从而使得该环肽在水溶液中组装成纳米棒、球状纳米粒子等结构。
 
多肽α-螺旋空间结构(a)以及Acetyl-EACARVAibAACEAAARQ-NH2肽(b)、FK-4-X 和FK-11-X 肽(c)光敏感自组装行为示意图
 
    β-折叠也是多肽类分子常见的二级结构, 空间结构表现为多肽链段通过平行(称为平行β-折叠)或反平行(称为反平行β-折叠)方式排列形成的薄片, 其内部作用力主要为多肽链段上肽键间的氢键作用(图1(a))。在众多的多肽自组装研究中, 反平行β-折叠结构居多。这是因为反平行β-折叠结构中多肽链段之间氢键距离(图2(b))相对平行β-折叠中氢键距离较短(图2(c),氢键作用相对较强. 研究表明,许多疾病,如Alzheimer 和Parkinson 等与体内蛋白β-折叠空间结构所导致的沉淀聚集有关[7-9]。基于β-折叠的多肽自组装研究很多,其中以亲疏水氨基酸残基相互穿插构成的多肽居多,一个典型代表Lego 肽。这种肽由极性和非极性氨基酸残基交替排列组成, 类似Lego 玩具上凸出的栓和凹陷的孔洞而得名。由于Lego 肽这种规则的分子结构(极性和非极性氨基酸交替排列), 多肽链段易在空间上通过氢键作用相互排列堆积形成β-折叠的二级结构. Yokoi 等[10]设计了由带正电荷的精氨酸(R)残基、带负电荷的天冬氨酸(D)残基和不带电荷的丙氨酸( A ) 残基交替排列的RADA16-I 肽([COCH3]-RADARADARADARA-DA-[CONH2], 图2(d)). 如图2(e)所示, 在水溶液中, 疏水的丙氨酸残基迅速彼此靠拢聚集以降低体系的能量, 而能够电离的天冬氨酸残基和精氨酸残基则通过静电作用相互吸引排列在组装体的外层. 由于丙氨酸残基是靠疏水作用力相结合, 而非化学键键合,丙氨酸残基可以横向滑移以减少其与水分子的接触, 最终使肽链的疏水面完全契合形成规整的具有β-折叠结构并自组装形成纳米纤维. 目前, RADA16-I 肽已经商品化(PuraMatrix), 应用于多种组织和细胞培养。
  图2 (a)多肽β-折叠二级结构;(b)多肽β-折叠二级结构中平行氢键作用;(c)多肽β-折叠二级结构中反平行氢键作用;(d)Lego型RADA16-I 肽分子3D模拟结构;(e)Lego 型RADA16-I 肽自组装过程中丙氨酸残基横向滑移形成规整的具有β-折叠结构的纳米纤维。
 
    β-发夹(β-Hairpin) 是多肽二级结构β-turn(β-转角)的衍变,类似于β-折叠结构, 是由Schneider 等提出的一种多肽结构模型。空间结构表现为多肽链段上氨基酸残基通过氢键作用形成的U形弯曲。构建β-发夹结构要求多肽链段中必须含有能够发生弯曲的氨基酸序列, 常见的是脯氨酸-甘氨酸(Pro-Gly)或者脯氨酸-苏氨酸(Pro-Thr)序列。Schneider[11]等利用多肽的固相合成技术先后制备了MAX1-7 七种可以形成β-发夹结构的多肽(图3(a)。在这些多肽分子结构中, 亲水性的赖氨酸(K)残基和疏水性的缬氨酸(V)氨基交替排列. 在酸性条件下, 质子化的赖氨酸残基之间的静电排斥作用使多肽分子不能形成β-发夹结构。升高溶液的pH值或增加溶液的离子浓度屏蔽静电排斥作用后, 多肽则可以形成以赖氨酸残基为内面、缬氨酸残基为外面的β-发夹结构, 并进一步利用其缬氨酸残基外面的疏水性作用自组装形成纳米纤维(图3(b))。由于MAX系列肽可以在细胞培养液DMEM 中自组装形成多肽凝胶, 因而可以作为细胞生长支架材料 以及药物控释载体。同时, 由于MAX 系列肽中存在可电离的赖氨酸残基, 由MAX 系列肽构成的多肽凝胶还具有一定的抑菌功能。 Schneider 等还进一步对MAX 系列肽进行化学修饰, 使得它们的自组装行为具有光、温等敏感特性。
 
3 (a)可以形成β-发夹空间结构的MAX1-7系列肽;(b)MAX系列肽通过构建β-发夹空间结构自组装形成纳米纤维和多肽凝胶。
 
1.1.3肽自组装的发展、意义和应用前景
除同种肽的自组装外,不同种类的肽自组装系统也得到发展和应用。例如:用作修复支架材料,组织工程和药物释放基质,甚至用于蛋白质折叠结构形成机理的研究等。有关进展可归纳为如下几个方面:
(1)20世纪中叶,随着结构化学和生物化学的发展,对天然蚕丝、胶原、角蛋白、肌浆球蛋白和纤维素等进行了广泛的研究。同时还开始研究利用氨基酸聚合物和它们的共聚物来制造新材料,并取得了一定成果。例如Trabbic和Seidel等利用降解的蚕丝和蜘蛛丝为原料重新组装生成一种性能更为优越的新材料,Rathore 和Sogah将AGAGAG 和AAAAAA肽分别引入降解蚕丝和蜘蛛丝重组得到新材料。这些研究表明,分子自组装为合成生物高分子提供了一种新的有效途径。
(2)在肽的自组装中,肽的设计是至关重要的,因为不同肽分子可以自组装成不同的宏观结构。Ryadnov和Woolfon根据亮氨酸肽链的结构设计SAF—pl和SAF一2a两种肽,并用它们自组装成纤维,这种肽链与其它亮氨酸链不同之处在于它的末端是赖氨酸,导致其自组装活性降低,易自组装成无支链纤维。当两种肽混合时,电子显微镜显示它们可以共同自组装成单一线性无侧链的纤维。作者对T形肽T—SAF的合成进行了设计,可在作为T 形的横梁肽的侧链上合成T的直立杆部,也可以将作为,横梁肽的侧链与杆肽的一端连接直接形成T型肽。当将T肽与以上两肽混合时,圆二色谱显示有直链和支链纤维共同生成。这为设计不同结构的肽来自组装成不同结构的纤维材料提供了新的途径。
 (3)对多肽自组装的研究有助于提供对蛋白质折叠结构的研究,还可以对一些重要生物现象进行模拟,如为生物体内信息和能量的传递和催化等过程提供简单的模型D43。从肽的a一螺旋到f}-折叠自组装再到三维功能系统的研究将是自组装肽系统今后发展的重点之一。
肽自组装系统的发展将有助于对生命现象的更深入了解,将从微观到宏观地在分子水平设计新材料,简单但多样的肽分子自组装系统的应用将为研究更复杂的原始生物现象提供可能,应用分子设计和自组装的分子工程将有可能在未来技术中起越来越重要的作用并改变人们的生活。
 
1.2 温度敏感性多肽聚合物
1.2.1 温度敏感性多肽聚合物概述
温敏性高分子是指对温度刺激具有响应性的智能型高分子, 如聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等,其在水溶液中存在一个低临界溶解温度(LCST),所谓LCST 就是指最低浊点温度。温敏高分子由于其特有的温度敏感性而广泛应用于药物缓释、物料分离提纯、温敏薄膜,酶的固定以及免疫分析等领域。
对于温敏高分子产生环境响应的机理,目前普遍被接受的观点是,感温高分子内同时存在亲水基团和疏水基团,他们在水中会与水分子产生相互作用,当温度低于LCST 时,大分子中的亲水基团与水分子作用,由于氢键及范德华力的作用,是大分子周围的水分子形成由氢键连接的溶剂化壳层,使高分子表现出一种伸展的线团结构,并且呈现出溶解于水的特性。当温度升高时,亲水基团与水分子之间形成的氢键断裂,溶剂化层被破坏,呈现疏水特性,并有线团变为紧密的胶粒状结构。通过整个大分子线团/胶粒的构象转变完成对温度变化的响应 [3]。目前最常见的温度敏感型聚合物为聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm),它的LCST 为30 度左右,根据以上所述的温敏机理,我们可以通过亲水性不同的两种温度敏感性单体按照一定比例共聚合,来扩大聚合物的温度响应范围。
  大自然是富含着各种各样的智能材料设计灵感的源泉。多肽是由氨基酸通过肽键,按一定的排列顺序链接而成的多聚体。多肽的分子大小介于氨基酸和蛋白质之间,同时也是蛋白质的重要组成部分。多肽和蛋白质一样,除具有特定的氨基酸序列(一级结构)外,还可以通过分子内的氢键、盐键、疏水键等次级相互作用形成丰富的二级结构。自然界中常见的多肽有20 种, 通过分子设计和多肽合成等手段可以得到许多种结构不同、功能不同的多肽。多肽作为生物体内各种细胞功能的生物活性物质,具有非常重要的生理作用,比如多肽可以作为神经递质、神经调节因子以及激素等。所以多肽是生命体中不可或缺的基本物质,多肽链段上氨基酸残基具有不同的化学结构,并且多肽自身具有良好的生物相容性和可控的降解性能。 多肽可以利用其肽键间氢键作用以及氨基酸残基之间的氢键作用、静电作用、疏水性作用以及π-π堆积作用等有效实现分子自组装[28],在溶液或固相中,多肽经过自组装可以形成许多种不同结构的组装体,如纤维、凝胶、纳米管和纳米片等。外部环境变化会影响其结构和性质发生相应改变,而这些变化通常伴随着多肤亲疏水基团空间上的重新排列。科学家们希望通过改变外部条件诱导多肤二次有序构象变化从而实现对多肤自组装的控制。同时,多肤通常还具有很好的生物相容性和生物可降解性,在组织工程、药物释放、生物传感器以及智能生物材料领域有巨大的潜在应用价值。因此,具有刺激-响应行为的智能多肽聚合物己经成为国内外高分子科研工作者关注的热门研究方向。通过多肽自组装,人们可以构建出各种功能性材料。其在药物控制释放、组织工程、支架材料以及生物矿化等领域内有着非常的应用前景。
 

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